在肿瘤治疗领域，自然杀伤（NK）细胞相较于T细胞的安全性和可靠性更为突出。特别是针对CD19靶点的嵌合抗原受体（CAR）-NK细胞已被证实在治疗淋巴B细胞肿瘤患者中具有安全性和有效性。然而，制作CAR-NK细胞的过程非常复杂且价格高昂。因此，本研究采用了一种称为“别针”（Pin）技术的非基因修改方法来生产抗肿瘤NK细胞。

该技术利用脐血来源的单个核细胞（PBMCs），结合细胞因子IL-2/IL-15及转染了爱波斯坦-巴尔病毒（EBV）的B淋巴母细胞，以生产NK细胞。在此基础上，通过改良的抗CD20和抗CD19抗体（增强对CD16a的亲和力）对NK细胞进行孵育和扩增。最终生成的NK细胞表面具有抗CD19/CD20抗体，借助抗体依赖性细胞毒性（ADCC）机制，对CD19或CD20阳性的肿瘤细胞展现出显著的杀伤效果，达成类似CAR-NK细胞的治疗效果。

别针单抗的生产和纯化过程中对人类IgG1的Fc的CH2结构域进行了四个氨基酸的替换：S239D/H268F/S324T/I332E。所有别针抗体均由位于法国Besançon的RD-Biotech生产，采用CHO细胞合成并通过蛋白A进行纯化。这些抗体的抗原结合域序列源自于临床上常用的单克隆抗体，如别针-CD20单抗对应利妥昔单抗，别针-HER2单抗对应曲妥珠单抗，别针-EGFR单抗对应西妥昔单抗，别针-CD19单抗则来自布纳吐莫单抗。

所有悬浮细胞（K562、Daudi、Toledo等）均购自ATCC或ECACC，并在含10% FBS的RPMI-1640 GlutaMAX培养基中进行培养。HCT116、MDA-MB-468、MCF7细胞则在含10% FBS的DMEM高糖培养基中生长。淋巴瘤细胞患者的样本来源于蒙彼利埃CHU的CRB-CHUM平台。

为定量检测抗体在细胞样本中CD19及CD20的绝对值，使用了BD藻红蛋白PE荧光定量试剂盒，配合BDFACSCantoII流式细胞仪进行分析。在NK细胞体外扩增过程中，利用EasySep人类CD3阳性分选试剂盒II从脐血单个核细胞中去除CD3阳性细胞，剩余的UCBMCs在含10% FBS的培养基中培养，并添加IL-2和IL-15。经过14至20天的培养结束时，使用70Gy辐照后的EBV转染B淋巴母细胞作为滋养层细胞按照比例加入。最终收集的NK细胞经过流式细胞术检测其表面标志物的表达情况。

在细胞毒性检测中，经过孵育的eNK细胞与CFSE或CellTraceFarRed标记的靶细胞以特定的E:T比进行混合后，在96孔板中共同培养，通过流式细胞术检测靶细胞的杀伤程度。同时，健康供体PBMCs来源的eNK或别针CD20eNK在E:T=1:1的情况下孵育16小时以作为对照。

对NSG小鼠进行的体内细胞毒性实验显示，接受别针注射eNK、别针CD20-eNK、别针CD19-eNK的小鼠在注射4小时后采集腹水细胞并进行流式细胞术分析，评估eNK细胞在体内的存活率及细胞毒性。小鼠体内白血病模型的实验中，静脉注射Raji细胞后，再对小鼠注射eNK或者别针-CD20eNK，结果表明后者能有效清除各个组织中的肿瘤细胞。

研究结果表明，eNK细胞和别针-CD20抗体的稳定结合，极大增强了NK细胞对抗原性B淋巴细胞的细胞毒性。CD19作为另一种表达广谱的靶标，已被应用于CAR-T和CAR-NK中，显示出针对CD20阳性或对利妥昔单抗产生耐药的B淋巴细胞瘤的潜在治疗效果。同时，双重别针武装的eNK展示了更好的细胞毒性谱，增强了对CD19及CD20阳性肿瘤的清除能力。

通过对临床应用单抗的Fc CH2结构域进行氨基酸替换，增强了其与NK细胞CD16a的亲和力，使其能够有效结合不同的靶标。这一方法不仅不需对NK细胞进行基因修饰，还可通过修改抗体针对多种潜在靶点进行靶向治疗，展现出极大的临床应用潜力，为未来的肿瘤免疫治疗拓宽了视野。

核心在于，通过尊龙凯时的技术手段，借助强化的抗体设计，eNK细胞的治疗效果得到了显著提升，具有与CAR细胞相媲美的治疗前景，成为抗肿瘤研究的重要突破。